Prima dell'esperimento, tutti i reagenti ei campioni devono essere bilanciati a temperatura ambiente; dopo la rifusione, i campioni devono essere nuovamente centrifugati e prelevare il supernatante per l'analisi; per la preparazione dei reagenti o dei campioni, miscelare ed evitare la formazione di schiuma; la calibrazione e i campioni sono consigliati per i test in duplicato.

1. Aggiungi ple: aggiungi la soluzione di lavoro standard ai primi due pozzetti a turno e aggiungi due fori per ogni concentrazione della soluzione di lavoro, 100 μ L di ciascun pozzetto. I campioni da testare vengono aggiunti ad altri pozzetti, 100 μ L per pozzetto (per concentrazione del campione superiore all'intervallo del test, campione diluito con diluizioni standard e del campione). La micropiastra è stata rivestita con film e incubata a 37 ℃ per 90 min. Suggerimento: quando si aggiunge il campione sul fondo della micropiastra, cercare di non toccare la parete del foro, agitare delicatamente e mescolare per evitare la formazione di bolle. Il tempo aggiuntivo dovrebbe essere controllato entro 10 minuti.

2. Anticorpo/antigene biotinilato: scartare il liquido e agitare per asciugare, senza lavare. 100 μL di soluzione di lavoro anticorpo/antigene biotinilato sono stati immediatamente aggiunti a ciascun pozzetto, miscelati, micropiastra più pellicola rivestita e incubati a 37 ℃ per 1 ora.

3. Lavaggio: agitare il liquido nel foro, aggiungere 350 μL di liquido di lavaggio in ciascun pozzetto, immergere per 1-2 minuti, aspirare o scrollarsi di dosso il liquido nella micropiastra e asciugare tamponando sulla carta assorbente spessa. Ripetere questo passaggio della piastra di lavaggio 3 volte. Suggerimento: la lavatrice può essere utilizzata qui e in altre fasi di lavaggio. Ogni fase del lavaggio è essenziale per l'esperimento.

4. Coniugato enzimatico HRP: 100 μ L di soluzione di lavoro coniugato enzimatico per pozzetto, miscelato, rivestito con pellicola e incubato a 37 ℃ per 30 minuti.

5. Lavaggio: eliminare il liquido nel pozzetto e lavare la piastra 5 volte allo stesso modo del passaggio 3.

6. Substrato: aggiungere 90 μL di soluzione di substrato (TMB) a ciascun pozzetto, mescolare bene, aggiungere il rivestimento con pellicola e incubare a 37℃ per circa 15 minuti. Nota: il tempo di incubazione deve essere ridotto o esteso in base all'effettiva situazione di sviluppo del colore, ma non oltre i 30 minuti. Può essere terminato quando appare un chiaro gradiente nel foro standard.

7. Risoluzione: aggiungere 50 μ L di soluzione di terminazione in ciascun pozzetto per terminare la reazione. Nota: l'ordine di aggiunta della soluzione di terminazione dovrebbe essere lo stesso di quello della soluzione di substrato.

8. Lettura: misurare immediatamente la densità ottica (OD) di ciascun pozzetto a 450 nm con un lettore di micropiastre. Il lettore di micropiastre deve essere aperto in anticipo per impostare la procedura del test.

9. Dopo l'esperimento, rimettere il reagente inutilizzato nel frigorifero in base alla temperatura di conservazione specificata fino alla data di scadenza.